接下來，內(nèi)蒙古嘧啶廠家對5的激酶選擇性進(jìn)行了評(píng)價(jià)

內(nèi)蒙古嘧啶發(fā)現(xiàn)其激酶選擇性很差，從化合物5與JAK1的共晶結(jié)構(gòu)（圖4）可以看出，化合物5的氨基嘧啶部分與鉸鏈區(qū)形成氫鍵，吲哚上的NH和酰胺Linker與Asp1021的羧酸側(cè)鏈形成氫鍵，并且觀察到了吡啶與His885的咪唑側(cè)鏈之間的相互作用，這一相互作用穩(wěn)定了P環(huán)，使得P環(huán)區(qū)能夠觀察到清晰的電子密度。5的吡唑環(huán)側(cè)鏈占據(jù)由Phe958、Pro960、Ser961和Gly962形成的小的疏水口袋，而這個(gè)小的疏水口袋在JAK2中是由Tyr931、Pro933、Tyr834和Gly934形成的。JAK2中的這個(gè)口袋對于取代基的空間要求更高，吡唑環(huán)上的甲氧基在其中的耐受性差，從而導(dǎo)致對JAK2的活性降低，提高了化合物對JAK1的選擇性。作者為了提高化合物的激酶選擇性重新合成了300多個(gè)6的酰胺類似物，發(fā)現(xiàn)化合物9具有中等的JAK1活性和良好的選擇性、水溶性以及穩(wěn)定性。在化合9與JAK1的共晶結(jié)構(gòu)（圖5）中可以看到，吲哚上的NH和酰胺Linker與JAK1的Asp1021氫鍵相互作用是不變的，有趣的是，手性哌嗪部分和Asp1003之間的鹽橋作用也很明顯，雖然P環(huán)周圍的電子密度很明顯，但由于該區(qū)域缺乏芳香環(huán)，配體不能與殘基形成直接的π?π相互作用，所以推測化合物9良好的選擇性是疏水相互作用，氫鍵以及環(huán)丙酰胺部分共同發(fā)揮作用的結(jié)果。在9的基礎(chǔ)上對Linker和哌嗪取代基進(jìn)一步探索，得到化合物10-14（表2），發(fā)現(xiàn)其活性和選擇性都差于化合物9。

于是，在化合物9的基礎(chǔ)上，作者重新對嘧啶環(huán)2位上的取代基進(jìn)行了改造。首先引入甲基吡啶取代基得到化合物15，發(fā)現(xiàn)其對于JAK1具有高度的選擇性，但是JAK1活性卻下降了，只有0.13 μM。將甲基換成較小的取代基氟以后，活性和選擇性都有改善，但是對于HERG離子通道有抑制作用(IC50=10 μM)。而引入2-甲氧基-1-甲基氨基吡唑形成化合物17，發(fā)現(xiàn)其活性和選擇性良好，對于HERG離子通道無抑制作用。（表3）

接下來，作者對嘧啶環(huán)5位上的取代基進(jìn)行了探索，內(nèi)蒙古嘧啶因?yàn)镴AK1具有蛋氨酸守門殘基，因此，疏水取代基或氫可能在C-5位置上是有利的。如表4所示，取代基的疏水性增加導(dǎo)致JAK1活性更高(18、19和20的IC50分別為7、19和8 nM)，然而，也觀察到JAK2活性具有相同的趨勢，并且18、19和20對于HERG離子通道也具有一定的抑制作用?？傮w而言，具有C5-H取代基的21表現(xiàn)出良好的JAK1活性、選擇性，并且沒有檢測到HERG活性。因此，作者選擇對它進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

化合物21在不同物種的肝細(xì)胞中表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，溶解性和透膜性良好（表5）。具有良好的跨物種藥代動(dòng)力學(xué)特性(表6)，在大鼠體內(nèi)清除率低(20mL/min/kg)，半衰期適中(6h)，口服生物利用度高。同樣觀察到21在犬體內(nèi)的低清除率(9 mL/min/kg)，長半衰期(9 h)，高口服利用度(71)。

為了了解化合物21的抗腫瘤活性，在NCL-H1975小鼠模型中評(píng)價(jià)了21與EGFR第三代抑制劑osimertinib聯(lián)合治療時(shí)的療效（圖6）。在聯(lián)合治療組中，與單獨(dú)使用osimertinib（紅色）相比，聯(lián)合使用21增強(qiáng)了抗腫瘤活性（綠色），但是單獨(dú)使用21時(shí)的抗腫瘤活性較弱（藍(lán)色）。在治療的后一天，聯(lián)合用藥對腫瘤生長的抑制作用與單藥22相比具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。所有治療耐受性良好，在治療過程中沒有觀察到明顯的體重減輕。

從一個(gè)初篩得到的化合物3出發(fā)，通過基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)方法，得到了活性和選擇性都較高的先導(dǎo)化合物9，為了進(jìn)一步提高活性和選擇性，通過繼續(xù)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了具有高度JAK1抑制活性和良好的DMPK特性的候選藥物21(AZD4205)。在臨床前NSCLC模型中，該化合物與批準(zhǔn)的EGFR抑制劑osimertinib聯(lián)合使用顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤活性，內(nèi)蒙古嘧啶這些發(fā)現(xiàn)值得在臨床試驗(yàn)中對化合物21開展進(jìn)一步的研究。