水產(chǎn)品中三類內(nèi)蒙古氨基嘧啶重要化學(xué)殘留物快速檢測方法的研究：

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)近年來蓬勃發(fā)展,但同時面臨著國際貿(mào)易技術(shù)壁壘的不斷增強(qiáng)以及國內(nèi)由于藥物濫用而導(dǎo)致的各類水產(chǎn)品安全問題的巨大挑戰(zhàn)。內(nèi)蒙古氨基嘧啶“打鐵還要自身硬”。最徹底的解決辦法還是建立合適的檢測方法和監(jiān)管體系加以防范,從根本上杜絕隱患。氯霉素、孔雀石綠、磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶作為水產(chǎn)品中殘留問題較為突出的藥物,建立更加嚴(yán)格的篩查辦法已勢在必行。酶聯(lián)免疫分析法和側(cè)流免疫分析法用于檢測這三大類化學(xué)殘留物具有便捷快速,高效穩(wěn)定等特點,適合水產(chǎn)品殘留的現(xiàn)場檢測。本課題從高效抗原的合成和篩選著手,經(jīng)過細(xì)胞融合后,進(jìn)一步篩查制備單克隆抗體,并開發(fā)相應(yīng)的快速檢測方法。首先從特征性功能基團(tuán)著手,通過混合酸酐法和碳二亞胺法等方法,以不同的摩爾反應(yīng)比合成多種氯霉素抗原,經(jīng)過紫外和凝膠電泳法鑒定后免疫動物,通過ELISA檢測篩選免疫效果好的免疫原、對應(yīng)的檢測抗原和免疫小鼠。經(jīng)過細(xì)胞融合和亞克隆,篩選出超靈敏的抗氯霉素單克隆抗體6F11。內(nèi)蒙古嘧啶通過對主要影響因素的優(yōu)化,確定了工作條件為:以CAP-OVA作為檢測抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀釋后進(jìn)行包被,實驗過程中調(diào)節(jié)洗液和抗體稀釋液的p H至7.0,顯色時間為15 min。在優(yōu)化條件下,ic-ELISA方法的IC50為0.010 ng/m L,線性范圍(IC20~IC80)為0.003 ng/m L~0.040ng/m L。其對氯霉素三種結(jié)構(gòu)類似物(FFC、FFA和TAP)都沒有交叉反應(yīng)。通過牛奶陰性樣本的添加回收實驗,ic-ELISA方法的回收率在98.9%~106.8%之間,變異系數(shù)小于10%。為節(jié)約大批量樣本的現(xiàn)場檢測時間,研究并建立了一步法檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線,單抗的IC50為0.025 ng/m L,線性范圍為0.009 ng/m L~0.067 ng/m L。內(nèi)蒙古氨基嘧啶基于側(cè)流免疫原理建立了氯霉素金標(biāo)試紙條,金標(biāo)抗體的工作條件為:1 m L膠體金溶液中,0.1mol/L K2CO3添加量為4?L,氯霉素單抗添加量為15?g,NC膜上包被氯霉素檢測抗原CAP-BSA濃度為0.8 mg/m L。優(yōu)化并檢測了牛奶中的氯霉素殘留,裸眼觀察判斷檢測限為0.3 ng/m L,用T線的顏色深度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測限為0.263ng/m L,線性范圍為0.116 ng/m L~0.596 ng/m L。金標(biāo)試紙條與ic-ELISA法檢測結(jié)果相一致,可以滿足牛奶中氯霉素殘留的檢測要求。檢測魚肉中的氯霉素殘留,裸眼觀察判斷檢測限為0.2 ng/g,檢測靈敏度可達(dá)到0.1 ng/g,該方法也適于水產(chǎn)品中氯霉素殘留的現(xiàn)場快速篩查。以同樣的思路制備了高靈敏的抗孔雀石綠單克隆抗體2E10,并建立了魚肉中孔雀石綠殘留的ic-ELISA檢測方法。通過對主要影響因素的優(yōu)化,確定了工作條件為:以CEO50作為檢測抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀釋后進(jìn)行包被,實驗過程中調(diào)節(jié)洗液和抗體稀釋液的p H至5.0,顯色時間15 min。在此條件下,ic-ELISA方法的IC50值為0.057 ng/m L,線性范圍為0.02 ng/m L~0.162 ng/m L。其對結(jié)晶紫的交叉反應(yīng)率為90.4%,與其他三苯甲烷類物質(zhì)沒有交叉反應(yīng)。通過魚肉樣本的添加回收實驗,此方法的回收率在98.5%~116.3%之間,變異系數(shù)小于10%?；趥?cè)流免疫原理建立了孔雀石綠金標(biāo)試紙條,金標(biāo)抗體的工作條件為:1 m L 30 nm膠體金使用濃度為5 nmol/L,酶標(biāo)二抗添加濃度為0.3 mg/m L,抗體添加濃度為0.2mg/m L,NC膜上包被4.5 mg/m L的檢測抗原(CEB30)。通過添加回收建立魚肉中三苯甲烷類物質(zhì)殘留的檢測方法,孔雀石綠總量和結(jié)晶紫總量的IC50分別為0.418 ng/g和0.532 ng/g,與孔雀石綠其他類似物無交叉反應(yīng)。應(yīng)用于水產(chǎn)品陽性樣本檢測,確定孔雀石綠的殘留量為195 ng/g樣本,實驗重復(fù)性較好。內(nèi)蒙古玉嘧磺胺篩選高效的完全抗原,進(jìn)而制備高靈敏的抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體10D6,建立ic-ELISA法檢測的IC50值為0.221 ng/m L,線性范圍為0.074 ng/m L~0.667 ng/m L,將此方法應(yīng)用于魚肉中添加回收實驗,平均回收率為79.6%~108.6%,變異系數(shù)小于10%。篩選高效的完全抗原,進(jìn)而制備高靈敏的抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體6C11,優(yōu)化實驗條件后,所建立ic-ELISA法檢測的IC50值為0.419 ng/m L,線性范圍為0.158ng/m L~1.110 ng/m L將此方法應(yīng)用于魚肉中添加回收實驗,內(nèi)蒙古氨基嘧啶平均回收率為96.3%~128.1%,變異系數(shù)小于10%,表明此方法檢測水產(chǎn)品中藥物殘留的可行性。